Как повысить точность оптической визуализации клеточной активности
Оптическая регистрация электрической активности клеток и динамики кальция помогает исследовать работу нервной системы, сердца и других биологических тканей. Однако качество таких данных ограничивают не только свойства сенсоров, но и фотонный шум, характеристики камер и источников освещения, рассеяние и аутофлуоресценция тканей, движение образца, фотоблеклость и ошибки локализации индикаторов. Разделение физиологического сигнала и помех особенно важно для высокоскоростных, количественных и длительных измерений.
Коллектив ученых, в который вошел доцент Института биомедицинских систем и биотехнологий СПбПУ Михаил Рязанцев, подготовил обзор факторов, влияющих на качество данных, и методов их минимизации в оптической визуализации. Работа посвящена четырем основным классам индикаторов: красителям, чувствительным к изменению мембранного потенциала, генетически кодируемым индикаторам напряжения, кальций-чувствительным красителям и генетически кодируемым кальциевым индикаторам.
Авторы систематизировали источники погрешностей по трем группам: фундаментальный фотонный шум, приборные ошибки и ошибки, связанные с биологическим образцом. Фотонный дробовой шум обусловлен статистическим характером регистрации света и не может быть полностью устранен. Его влияние особенно заметно при высокоскоростной съемке, работе с тусклыми сенсорами и двухфотонной микроскопии. Приборные искажения связаны с темновым и считывающим шумом камеры, колебаниями интенсивности освещения, вибрациями и особенностями сканирующих систем. К ошибкам образца относятся рассеяние, аутофлуоресценция, движение тканей, фотоблеклость, токсическое воздействие индикаторов и их неточная локализация.
Результаты обзора показали, что повышение качества измерений требует согласования всех этапов эксперимента. Среди возможных стратегий авторы рассматривают выбор более ярких, чувствительных и фотостабильных индикаторов, применение сенсоров с длинноволновым смещением спектра, охлаждение камер, стабилизацию источников света и использование объективов с высокой числовой апертурой. Для визуализации в тканях важное значение имеют двух- и трехфотонная микроскопия, коррекция движений и спектральное разделение сигналов.
Отдельное внимание уделено обработке данных. Усреднение повторяющихся измерений, пространственная и временная фильтрация, алгоритмы коррекции движения, спектральное разделение и методы снижения размерности помогают уменьшить влияние случайных шумов и фоновых сигналов. Авторы также отмечают преимущества рациометрических сенсоров: отношение двух флуоресцентных сигналов снижает зависимость результата от колебаний освещения, концентрации индикатора и умеренных перемещений образца. При этом такие методы не устраняют все источники ошибок и требуют корректной калибровки и настройки эксперимента.
Авторы продемонстрировали, что особенно высокие требования предъявляются к визуализации мембранного потенциала. Сенсоры напряжения локализованы в тонком слое клеточной мембраны и должны регистрировать быстрые изменения, тогда как кальциевые индикаторы обычно дают более длительные сигналы, связанные с изменением концентрации и распределением ионов кальция в клетке. Поэтому кальциевый сигнал не следует автоматически интерпретировать как прямое измерение мембранного напряжения: он отражает совокупный результат процессов поступления, высвобождения, связывания и удаления кальция.
